“肿瘤杀手”NK细胞异军突起，赛默飞CTS无需饲养层培养基再助力丨医麦猛爆料

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2021年8月28日/医麦客新闻 eMedClub News/--近年来，CAR-T和NK细胞疗法如同之前的抗体治疗一样逐渐杀出重围，成为“异军突起”的明星治疗方法。

虽然CAR-T细胞免疫疗法的临床应用最为广泛，越来越多的CAR-T产品逐渐上市。然而已经进入市场的CAR-T疗法所展现出的疗效主要集中于血液系统肿瘤，在治疗市场体量更大的实体瘤时，仍存在疗效不足、无法有效靶向目标等问题。因此，科学家们开始尝试使用杀伤能力更为直接的NK细胞疗法进行肿瘤治疗。

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NK细胞的独特优势

科研人员于20世纪60年代鉴定出NK细胞，发现其具有杀伤癌细胞及被感染体细胞的功能。NK细胞的表型为CD3^- CD56⁺，大致分布于骨髓、外周血和脾脏当中。

与其他免疫细胞不同，NK细胞是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞，具有广谱的抗肿瘤作用。NK细胞表面标志的特异性是相对的，是表达激活受体和抑制受体的随机组合。通过不同受体表达的刺激信号与抑制信号的平衡使NK细胞表现出对靶细胞的应答或耐受。这是NK细胞区别于T细胞相关肿瘤免疫治疗的一大优势。

另一优势在于，NK细胞能够靶向主要组织相容性复合体（MHC）缺失的肿瘤细胞，通过释放细胞毒性穿孔素和颗粒酶，从而诱发肿瘤细胞凋亡；亦可通过分泌一系列细胞因子，如γ干扰素（IFN-γ）及肿瘤坏死因子（TNF）等，调节免疫反应而间接杀伤肿瘤细胞。因此，NK细胞在抗肿瘤免疫细胞治疗中具有巨大的潜力。

关于NK细胞与在癌症免疫治疗中的临床前研究还显示，NK细胞在临床应用中表现出较高的安全性。例如，CAR-NK细胞没有出现严重的移植物抗宿主病(GVHD)以及高级别细胞因子风暴。同时NK细胞分泌的PD-1水平较低，免疫抑制作用较小，这使NK细胞成为抗实体瘤的理想候选细胞。

这些特点大大提高了NK细胞的安全性，即使是异体细胞过继治疗，也是相对安全的。目前，NK细胞已经尝试做成off-the-shelf“现货”产品，增加了治疗可及性。

NK细胞疗法治疗实体瘤的研究

事实上，国外多家企业已经开展多项NK的肿瘤细胞免疫治疗的临床试验。例如Fate Therapeutics、Nkarta、Exacis Biotherapeutics等多家公司，多集中于血液肿瘤研究以及尝试解决CAR-T未能解决的实体瘤。

Fate

Fate是国际上开发NK细胞较早的企业，管线内有多款iPSC来源的NK细胞候选产品，目前已经推进到临床1期研究用于联合CD20靶向单克隆抗体联合治疗晚期B细胞淋巴瘤。

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Nkarta

Nkarta是一家临床阶段生物制药公司，拥有多款NK细胞候选产品，其中进展较快的有治疗复发/难治性急性髓系白血病的NKX101，以及刚获得美国食品药品监督管理局（FDA）临床试验的IND许可的CAR-NK产品NKX019，该药物主要用于治疗复发性/难治性B细胞恶性肿瘤。

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ImmunityBio

ImmunityBio是一家处于临床阶段的免疫治疗公司，该公司NK细胞治疗候选产品已经在临床试验QUILT88中成功给药。

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随着研究的深入和技术的积累，NK细胞也吸引了国内众多开发商的布局和投资。

国健呈诺

国健呈诺是一家以基因和细胞治疗、人工智能为核心技术平台,专注于肿瘤治疗研发,尤其是CAR-NK细胞治疗实体肿瘤。目前，其针对晚期上皮性卵巢癌治疗的“靶向间皮素（MSLN）嵌合抗原受体NK细胞（CAR-NK）注射液”的临床试验申请已被CDE受理。

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百济神州

百济神州是一家全球性、商业阶段的生物科技公司，目前正与iPSC来源的NK细胞疗法公司Shoreline开发并商业化一系列基于NK细胞疗法的产品组合，用于治疗各类恶性肿瘤。

普米斯生物与艾凯生物科技

普米斯与艾凯生物科技近期正式达成全球战略合作，利用艾凯的iPSC NK细胞治疗技术和普米斯的临床前研发和临床能力共同开发两款针对实体瘤的iPSC-CAB-NK细胞治疗产品。

NK疗法开发中遇到的问题

尽管NK细胞疗法吸引了很多研究者的目光，其也存在一定问题。NK细胞疗法的成功实施目前受到NK细胞输液的持久性以及它们的增殖潜力的限制。

来自过继细胞疗法临床试验的证据通常无法在输注后1-2周内检测到输注NK细胞的存在。虽然NK细胞的短寿命有助于它们在过继性免疫细胞回输（ACT）环境中的安全性，但它也缩小了治疗窗口。

在外周血单个核细胞中NK细胞约占5%-20%，并且来自白细胞去除术产品的数量高度依赖于供体。以NK细胞为基础的过继性免疫治疗需要大量的细胞，并需多次回输。因此，对于NK细胞治疗来说，它的扩增需求较其他种类要高，也对生产工艺提出更高的要求。

此外，从外周血淋巴细胞中分离的原代NK细胞在低温保存后细胞毒性降低，它们在使用过程中的操作将更加复杂。如何有效分离并扩增至足够治疗剂量成为NK疗法的主要技术瓶颈。

目前已经有部分方案来扩增NK细胞，但是由于传统细胞培养过程中使用动物来源的组分，例如血清和饲养细胞，使得许多现行的方案并不能够满足开发临床应用的要求和规范。依赖饲养层细胞的培养体系具有高度复杂性和可变性，同时行业也对这一过程中某些培养基组分会被转移到治疗细胞中表示担忧。

因此，安全高效的生产方法是获得大量功能性NK细胞的关键，也是NK研究和临床应用准备过程的必要基础。

NK细胞培养技术

NK细胞无血清培养基和无血清培养技术成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产成本，简化分离纯化步骤，避免病毒污染造成的危害。赛默飞的Gibco CTS NK-Xpander培养基能在不需要饲养细胞的情况下可靠地提供高产量的功能性NK细胞。

▲Gibco CTS NK-Xpander培养基

● 性能优异——能够在无饲养层细胞条件下扩增高产量的人NK细胞（图1）；细胞可维持CD56⁺和CD16⁺的高表达并具有功能性（图2、图3）；

●专为法规合规性而设计——用于研究或生产基于细胞、基因或组织的产品；无动物源成分，GMP生产符合21CFR第820部分、USP<1043>和欧洲药典5.2.12；有助于满足对用于细胞和基因治疗生产的辅料的法规要求；提供法规支持文件，包括DMF、RSF、COO和COA；

●提供与封闭式系统兼容的包装形式——500mL瓶装和5L袋装套装形式，便于工艺开发和扩大封闭式系统生产规模。

图1.随时间变化的扩增倍数。CTS NK-Xpander培养基的扩增倍数显著高于其他培养基系统（p<0.0001），包括专用的无饲养层NK细胞培养基（Supplier1）。小规模培养14天后，NK-Xpander中NK细胞的的平均扩增倍数大于1,500。数据来自20个不同的NK细胞供体。

图2.剂量依赖性NK细胞脱颗粒。表面CD107a表达证明，在CTS NK-Xpander培养基中扩增的NK细胞能够以剂量依赖性方式脱颗粒。每个点代表一个NK细胞供体。

图3. NK细胞的溶解细胞功能。在CTS NK-Xpander培养基中扩增的NK细胞能够以剂量依赖性方式杀死K562靶细胞。每个点代表一个NK细胞供体。

NK细胞的封闭式自动化处理

图4：NK细胞的封闭式自动化洗涤回收。培养21天后，采用未优化的方案，使用Gibco CTS Rotea对扩增得到的NK细胞进行洗涤和浓缩后，可观察到84%的细胞回收率和97%的细胞活力。

值得一提的是，CTS NK-Xpander还与多种自动化封闭式设备兼容，以满足日益严格的细胞治疗生产要求。NK细胞在含有CTS NK-Xpander的Wolf G-Rex中扩增系统达到65亿个细胞之多，扩增后的NK细胞，通过赛默飞Gibco™ CTS™ Rotea™逆流离心系统进一步进行后续洗涤和浓缩后，可回收84%的NK细胞，且保留了优异的细胞活性。

多功能CTS Rotea逆流离心系统也是赛默飞推出的新品，是一种高度通用的细胞处理系统，具有出色的灵活性，低至5mL的输出体积，能保证出色的细胞回收效率以及细胞活率。系统内置用户可编程的软件、大量细胞处理应用程序，可以高效、灵活地进行细胞的分离、浓缩、洗涤、缓冲液和冻存液置换，能整合至cGMP细胞治疗生产工艺中，旨在帮助细胞治疗产品从实验室研发环节转化到临床试验、乃至商业化生产中。

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总结

目前NK细胞临床试验大多数还处于比较早期的阶段，未来需要在现有的细胞培养技术的基础上，不断提高NK细胞治疗的有效性和安全性，优化生产（降低成本，缩短生产周期，优化工艺），扩大治疗范围。